Células para cultivo de norovirus.

Norovirus
El norovirus humano (HuNoV) es una causa importante de gastroenteritis infecciosa intestinal, que puede provocar una enfermedad que puede ser mortal, especialmente en niños y en personas de edad avanzada. Los estudios de norovirus están muy limitados porque el virus no puede crecer fácilmente en un laboratorio. Muchos investigadores han intentado proporcionar métodos simplificados para cultivar norovirus pero ninguno ha tenido éxito, hasta ahora.
Shintaro Sato (Mucosal Vaccine Project, BIKEN Innovative Vaccine Research Alliance Laboratories, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University, Japan) y otros siete autores han publicado en Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology el desarrollo de un sistema simple y eficiente para la producción de norovirus.

Un equipo de investigación dirigido por la Universidad de Osaka ha desarrollado un sistema para producir norovirus humanos de manera. Al inducir a las células madre pluripotenciales humanas (iPSCs) para que se conviertan en un tipo de célula que generalmente recubre el intestino, crearon un entorno celular que puede usarse para reproducir el virus, estudiar cómo interactúa con las células humanas e investigar posibles vacunas.
Shintaro SatoAntes de este estudio, el norovirus humano podía cultivarse en el laboratorio pero requería tejido intestinal humano y bilis. La principal limitación de este diseño es que estos productos humanos se obtienen a través de métodos quirúrgicos, como la biopsia, por lo que solo están disponibles en cantidades limitadas.
El nuevo método utiliza células epiteliales intestinales (IECs) producidas a partir de iPSCs, que en teoría están disponibles en cantidades casi ilimitadas y estas nuevos IEC no requieren el uso de bilis para producir grandes cantidades de norovirus humano.

Como ejemplo preliminar de dicha aplicación, los investigadores utilizaron el nuevo sistema para identificar que un tipo menos conocido de norovirus, GII.17, podría ser mejor que el tipo predominante de norovirus, GII.4, como base para una vacuna porque es efectivo contra los norovirus GII.17 y GII.4. Este hallazgo, junto con el nuevo sistema celular para producir norovirus, puede ayudar a proporcionar vacunas nuevas y más efectivas contra el virus, mucho más rápidamente.
Los investigadores del estudio, junto con otros, lograron recientemente establecer un tipo de células epiteliales intestinales (IECs) a partir de células madre pluripotenciales inducidas. Durante la diferenciación de estas IECs, la expresión de ARNm de LGR5 se reguló a la baja, mientras que los ARNm de ambos marcadores de enterocitos aumentaron drásticamente. Cuando estas células crecieron en membranas Transwell, se establecieron monocapas bien polarizadas de IECs con la expresión de villos-1 (enterocitos) y E-adesina en las interacciones célula-célula). Además, las IECs polarizadas mostraron una formación de microvillos maduros, que son receptores importantes para la fijación de HuNoV de tipo GII.4.

Micrografía norovirus humano

Los investigadores primero evaluaron si HuNoV podía reconocer e invadir los IECs derivados de iPSC. Las IECs polarizadas en membranas Transwell se incubaron con virus de genotipo GII.4 o partículas similares a los virus (VLP), y luego las membranas se tiñeron con anticuerpo anti-GII.4-VP1 (Ab) o se seccionaron y se tiñeron con anti GII.4-P1 Ab simultáneamente con anti-villin-1 Ab. Se observaron tanto HuNoV como VLP en 30% a 50% de las IECs (villin-1-positivas). A continuación, investigaron si los HuNoV se podían replicar en las IECs derivadas de iPSC humanas.

El genotipo GII.4 se puede replicar agregándole a las IECs primarias humanas, mientras que la replicación de algunos de los otros genotipos, como GI.1, GII.3 y GII.17, requiere suplementación de bilis. La replicación de los genotipos GII.4, GII.3 y GII.17 en las células dependió del tiempo.

Los genotipos GII.4 (lote 17B93) y GII.17 también podrían pasarse en las IECs derivadas de iPSC, a pesar de que la replicación del virus GII.4 se degradó en los pases. Es interesante observar que la suplementación de bilis mejoró la replicación de todos los genotipos de HuNoV estudiados en las IECs derivadas de iPSC.

A continuación, se probó si las IECs podrían usarse para probar la inactivación de HuNoV. Los virus GII.4 o GII.17 se incubaron a 60 °C. Ambos HuNoV se inactivaron casi por completo después de 60 minutos de incubación. La incubación durante media hora con hipoclorito de sodio al 0,1% también fue suficiente para la inactivación de los virus GII.4.
En el trabajo se demuestra que las IECs derivadas de iPSC humanas establecidas podrían ser invadidas y utilizadas como sitios de replicación de los genotipos GII.3, GII.4, GII.6 y GII.17 de HuNoV sin suplementación de bilis. Debido a que las iPSC humanas se pueden usar con menos preocupaciones éticas que en el caso de la biopsia humana y los tejidos quirúrgicos, las IECs derivadas de iPSCs deberían convertirse en sistémas útiles para aplicaciones industriales, incluidas la evaluación de vacunas candidatas y respuesta inmune de Ab en ensayos clínicos. Los hallazgos sugirieron que, en este sistema, las VLP GII.17 eran más eficientes que las VLP GII.4 como antígenos de vacuna desde la perspectiva de la reactividad de genotipo cruzado.
Sato S, et al. Human norovirus propagation in human induced pluripotent stem cell-derived intestinal epithelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology, 2018; DOI: 10.1016/j.jcmgh.2018.11.001