FPCR y MiSeq virus ARN

Detección de alto rendimiento y genotipado de virus ARN patógenos humanos en heces, aguas residuales y ostras

3unoMamoru Oshiki (Department of Civil Engineering, National Institute of Technology, Nagaoka, Japan) y otros 15 autores, han publicado en Frontiers in Microbiology, un artículo sobre la detección de alto rendimiento y genotipado de virus de ARN patógenos humanos en heces humanas, aguas residuales y ostras.

3dosLa detección y el genotipado de virus de ARN patógenos en muestras humanas y ambientales son útiles para controlar la circulación y la prevalencia de estos patógenos, aunque un ensayo de PCR convencional seguido de la secuenciación de Sanger requiere mucho tiempo y es laborioso.

El estudio llevado a cabo por los autores tuvo como objetivo desarrollar un sistema de detección y genotipado de alto rendimiento para 11 virus de ARN humanos [virus Aichi; astrovirus; enterovirus; norovirus genogroupos GI, GII y GIV; virus de hepatitis A; virus de hepatitis E; rotavirus; sapovirus; y parecovirus humano] usando un dispositivo de PCR en microfluídos y un secuenciador de los llamados de próxima generación (NGS).

La PCR anidada en microfluidos se llevó a cabo en un chip Access Array 48,48, y los amplicones se recuperaron y se usaron para la secuenciación con MiSeq (Illumina, Tokio, Japón). El genotipado se realizó por búsqueda de homología y análisis filogenético de las lecturas de secuencia obtenidas.

3tresEl límite de detección de los 11 virus evaluados varió de 100 a 103 copias/μL en la muestra de ADNc, que corresponde a 101-104 copias/mL de aguas residuales, 105-108 copias/g de heces humanas y 102-105 copias/g- tejido digestivo de ostras. El ensayo desarrollado se aplicó con éxito para la detección y genotipificación simultáneas de virus de ARN en muestras de heces humanas, aguas residuales y ostras contaminadas artificialmente.

 

3cuatroEl secuenciador MiSeq arrojó >20 000 lecturas por muestra, lo que permite la identificación de virus de baja concentración en las muestras (por ejemplo, NoV GII.4 en una muestra fecal).

La PCR anidada en microfluídos seguida de la secuenciación de MiSeq permite la detección y seguimiento eficiente del destino de múltiples virus de ARN en diversos entornos, lo que es esencial para una mejor comprensión de la circulación de estos patógenos humanos.
Mamoru Oshiki, et al. Microfluidic PCR amplification and MiSeq amplicon sequencing techniques for high-throughput detection and genotyping of human pathogenic RNA viruses in human feces, sewage, and oysters. Front. Microbiol 2018; 9: 830. doi: 10.3389/fmicb.2018.00830

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.00830/full