MALDI-TOF MS y detección de la resistencia antifúngica

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La tecnología MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) ha hecho posibles avances revolucionarios en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Además de permitir una identificación rápida y confiable de bacterias y hongos, esta tecnología se ha aplicado recientemente para la detección de determinantes de resistencia antimicrobiana. Entre los métodos más ampliamente estudiados se encuentran la evaluación de la actividad de la β-lactamasas mediante la visualización de la hidrólisis del anillo de la β-lactámico, la detección de genes o péptidos que confieren resistencia a los antibióticos, la identificación de biomarcadores correlacionados con la resistencia a los medicamentos/no sensibilidad, y la comparación de los perfiles proteómicos de bacterias/levaduras incubadas con o sin medicamentos antimicrobianos.

Las técnicas e instrumentos de MS son cada vez más efectivos y precisos, así como la posibilidad de optimizar la configuración de parámetros analíticos para aplicaciones específicas, lo que ha generado un área de expansión en el diagnóstico de microbiología clínica. La resistencia antimicrobiana a una serie de antibióticos pertenecientes a diferentes clases ha sido probada con éxito, abriendo este campo a otros desarrollos clínicamente importantes. Se están evaluando las aplicaciones especiales de MALDI-TOF MS para la detección temprana de microorganismos farmacorresistentes en enfermos con infecciones del torrente sanguíneo, lo que permitiría un considerable ahorro de tiempo en la racionalización de la terapia con antibióticos para un mejor resultado de los pacientes críticamente enfermos.

En el estudio que comentamos, Walter Florio (Università degli Studi di Pisa, Italia) junto con otros autores de la misma institución y de Pisa, han publicado en Frontiers in Microbiology, a modo de revisión y experiencia personal, como están los últimos conocimientos sobre la aplicación del MALDI-TOF MS en la detección de la resistencia a los antifúngicos y revisan el estado de las aplicaciones de MALDI-TOF MS en la evaluación de resistencia/no susceptibilidad antimicrobiana, y se discuten desarrollos de vanguardia.

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Un campo interesante es la identificación de patógenos fúngicos y pruebas de sensibilidad antifúngica. La incidencia de infecciones fúngicas invasivas ha aumentado constantemente durante las últimas décadas, principalmente debido al creciente número de enfermos inmunocomprometidos y, por lo tanto, uso prolongado de antibióticos de amplio espectro. Además de las especies más comúnmente aisladas, como Candida albicans y Aspergillus spp., se han aislado con mayor frecuencia varios patógenos fúngicos emergentes, incluyendo Candida glabrata, Trichosporon spp., y hongos filamentosos como Scedosporium spp., Fusarium spp. y Mucorales.

 

El MALDI-TOF es una técnica adecuada para la identificación rápida y habitual de hongos clínicamente relevantes; sin embargo, debido a su gruesa pared celular, obtener espectros de alta calidad MALDI-TOF MS de patógenos fúngicos es más difícil que para la mayoría de las especies bacterianas y requiere optimización y estandarización de los medios de cultivo, condiciones de crecimiento y procedimientos de extracción. Es adecuado que las células fúngicas se lisen en ácido fórmico al 70% y/o por rotura mecánica en batidora con perlas de vidrio.

Las infecciones sistémicas por Candida spp. se caracterizan por altas tasas de mortalidad, especialmente cuando se asocian al shock séptico y si no se administra oportunamente un tratamiento antimicótico eficaz. Dado que las diferentes especies de Candida se caracterizan por diferentes perfiles de sensibilidad a los agentes antifúngicos, una identificación rápida de la especie puede tener gran repercusión en los tratamientos de los enfermos. Las tasas de identificación correctas por MALDI-TOF MS directamente en hemocultivos positivos se han correlacionado con el procedimiento utilizado y la carga fúngica.

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En el caso de las levaduras, se aplicó un enfoque combinado en los hemocultivos a muy corto plazo mediante la evaluación de la identificación MALDI-TOF MS mientras se usaban los mismos sedimentos celulares de levadura para inocular las tarjetas Vitek 2 para pruebas de sensibilidad antifúngica (PSA). Los resultados de la prueba PSA se obtuvieron para el 72,7% de los hemocultivos positivos probados directamente por Vitek 2 y el acuerdo esencial fue del 88,6%: sin embargo, para algunos de los aislados, la prueba se abortó y el rendimiento para la prueba de sensibilidad a los azoles fue inferior al óptimo. Un método alternativo se basa en la colocación de pequeñas alícuotas de hemocultivo, después de la lisis, en medios sólidos antes de que los hemocultivos se volvieran positivos, seguido por un análisis MALDI-TOF MS de microcolonias de levadura. Este método permitió identificar diferentes Candida spp. en muestras de sangre; sin embargo, se debe evaluar la aplicabilidad de este método en un flujo de trabajo habitual de laboratorio.

Otro enfoque interesante para un diagnóstico rápido de candidemia se basa en la detección de biomarcadores específicos en sueros de enfermos con candidiasis invasora. Unos autores en particular, mediante el análisis de MS MALDI-TOF, identificaron un disacárido correspondiente a un pico específico de m/z 365 en sueros de enfermos con candidemia, aunque otros estudios ayudarán a evaluar la utilidad clínica de este biomarcador para un diagnóstico temprano de la candidemia.

Un método prometedor para detectar la resistencia específica a agentes antifúngicos se basa en la comparación de los espectros MALDI-TOF MS de un aislado de levadura después de la incubación con concentraciones antifúngicas altas, intermedias o nulas. Utilizando este enfoque, los autores evaluaron la resistencia a los triazoles de C. albicans, C. tropicalis y C. glabrata. La concordancia esencial entre la MALDI-TOF EM y la PSA convencional osciló entre 54 y 97%, y la reproducibilidad del ensayo de MALDI-TOF EM entre 54,3 y 82,9%, dependiendo del fármaco triazol y especies de Candida; no obstante, el ahorro de tiempo con este método sobre el método de referencia PSA fue modesto (durante la noche frente a las 24 h). En un estudio similar, una incubación de 3 horas demostró ser suficiente para la detección de resistencia a caspofungina en aislados de C. albicans.

Florio W, et al. MALDI-TOF MS applications to the detection of antifungal resistance: state of the art and future perspectives. Front Microbiol 2018; doi: 10.3389/fmicb.2018.02577